Détection de gènes différentiellement exprimés à partir de données RNA-seq

Introduction

Depuis l’avénement du du séquençage massivement parallèle (NGS, Next Generation Sequencing) en 2007, la détection de gènes différentiellement exprimés (DEG) à partir de données transcriptomiques RNA-seq constitue l’une de ses application les plus populaires.

Le principe est de mesurer, dans différentes conditions, la concentration d’ARN correspondant à chaque gène, et de comparer ces concentrations entre les échantillons de deux (comparaison à 2 groupes ou binaire) ou plusieurs conditions (comparaison multi-groupes).

Dès les premières analyses, les chercheurs se sont rendus compte que les méthodes classiques d’analyse différentielles (tests de Student, ANOVA) ne se prêtaient pas du tout à l’analyse de telles données, car leur nature diffère fondamentalement des hypothèss de travail sous-jacentes, pour différentes raisons.

Le niveau d’expression d’un gène est quantifié sur une échelle discrète (comptage du nombre de lectures alignées qui chevauchent le gène), alors que les tests paramétriques reposent sur une hypoothèse de normalité.
Les ordres de grandeur des comptages varient fortement d’un gène à l’autre: certains gènes ont une poignée de comptages par échantillons, d’autres des centaines de milliers. Les gènes très très fortement représentés correspondent généralement à des gènes non-codants (par exemple ARN ribosomique) ou à des fonctions cellulaires particulières liées au métabolisme de l’ARN, et on comprend les raisons biologiques de leur sur-représentation. Ils n’en constituent pas moins ce qu’on appelle en statistique des “valeurs aberrantes” (“outliers”).
Les distributions de comptages comptent généralement un très grand nombre de valeurs nulles (“zero-inflated distributions”).
Ces particularités posent des problèmes particuliers pour la normalisation des librairies de comptages :
- la présence d’outliers affecte fortement la moyenne, et de façon très instable, ce qui biaise fortement l’estimation de la tendance centrale.
- la stratégie de repli sur des estimateurs robustes, comme la médiane est contestable du fait du très grand nombre de valeurs nulles (dans certains cas, plusn d’un quart voire la moitié des gènes ont une valeur nulle pour un échantillon).

Des méthodes spécifiques ont donc été développées dès 2010 pour affronter ces difficultés particulières de la normalisation et de l’analyse différentielle des données de RNA-seq.

But de ce TP

Le but de ce TP est d’effectuer une première exploration de l’analyse différentielle des données d’expression, sur base d’un petit cas d’étude simple: l’analyse transcriptionnelle de mutants de sporulation chez la levure Saccharomyces cerevisiae.

Cas d’étude

… A ECRIRE: DESCRIPTION DU CAS D’ETUDE

Sources des données

Paramètres de l’analyse

Nous définissons dans une variable R (de type liste) les paramètres de l’analyse. Ceci nous permettra de reproduire ultérieurement exactement la même succession d’étapes soit en utilisant des données différentes, soit en modifiant les paramètres particuliers (design, seuils, …).

## Load libraries
message("Loading libraries")
library(knitr)
#library(kableExtra) ## Note: kableExtra has some side effect on kable: column padding is null, so all numbers seem to be mixed up
#library(FactoMineR)
# library(clues)
#library(RColorBrewer)
# library(ComplexHeatmap)
library(vioplot)
library(DESeq2)
library(edgeR)

# library(corrplot)
# library(ClassDiscovery)
# library(formattable)

# message("getwd()\t", getwd())

parameters <- list(
  # data.folder = "data/GSE89530", # dossier des données locales
  data.folder = "/shared/projects/du_bii_2019/data/module3/seance5/GSE89530", # on the IFB-cluster-core
  workdir = "~/DU-Bii/m3s5/", # Directory to export the results
  counts = "GSE89530_counts.tsv.gz",
  sample.descr = "GSE89530_samples.tsv.gz",
  alpha = 0.05, # seuil de significativité
  epsilon = 0.1, # pseudo-comptage pour la transformation log2
  gene.filter.percent.zeros = 90, # Discard genes having zero values in more than this percentage of samples
  gene.filter.min.count = 10, # Minimal counts per gene
  
  ## Test and control groups for differential analysis
  test.group = "bdf1_Y187F_Y354F_mutant_8",
  control.group = "Wild_type_8"
)

## Create output directory
dir.create(parameters$workdir, showWarnings = FALSE, recursive = TRUE)

## Print the parameter values in the report
kable(t(data.frame(parameters)), col.names = "Parameter Value")

	Parameter Value
data.folder	/shared/projects/du_bii_2019/data/module3/seance5/GSE89530
workdir	~/DU-Bii/m3s5/
counts	GSE89530_counts.tsv.gz
sample.descr	GSE89530_samples.tsv.gz
alpha	0.05
epsilon	0.1
gene.filter.percent.zeros	90
gene.filter.min.count	10
test.group	bdf1_Y187F_Y354F_mutant_8
control.group	Wild_type_8

Téléchargement des données

## List files in the data folder
# list.files(parameters$data.folder)

## Load sample descriptions
message("Loading sample descriptions from file\t", parameters$sample.descr)
samples <- read.delim(file.path(parameters$data.folder, parameters$sample.descr), row.names = 1, header = TRUE)
# View(samples) # Check visually the content of the samples data frame

## Load counts of reads per gene
message("Loading counts from file\t", parameters$counts)
counts <- read.delim(file.path(parameters$data.folder, parameters$counts), row.names = 1, header = TRUE)

## Check that the count table contains the same sample IDs as the sample description table. If not, stop everything here.
if (!setequal(rownames(samples), colnames(counts))) {
  stop("The sample IDs differ between count table (column names) and sample descriptions (row names). ")
}

## Check that sample IDs are ordered in the same way between sample descriptions (rows) and count table (columns). 
differing.IDs <- colnames(counts) != rownames(samples)
if (sum(differing.IDs) > 0) {
  ## If not, re-order columnts of the count table to match the rows of the sample description.  
  message("Reordering columns of the count table in order to match the order of sample descrition row names")
  counts <- counts[, rownames(samples)]
  
}

La table de comptages comporte 7478 lignes (correspondant aux gènes) et 18 colonnes (correspondant aux échantillons). Nous pouvons afficher un petit morceau de cette table, ens électionnant au hasard quelques lignes et colonnes.

some.genes <- sample(1:nrow(counts), size = 10, replace = FALSE)
some.samples <- sample(1:ncol(counts), size = 4, replace = FALSE)

kable(counts[some.genes, some.samples], caption = "Random selection of some genes and some columns of the raw count table. ")

Random selection of some genes and some columns of the raw count table.
	GSM2375285	GSM2375295	GSM2375282	GSM2375288
YLR221C	312	486	307	156
YJL037W	706	3270	15	12
YOR252W	263	477	233	148
YKL166C	129	156	109	68
YJL052W	666	465	856	830
YLL018C-A	597	450	724	482
YOR337W	500	1194	729	489
YJL122W	274	634	323	117
YIR007W	443	169	465	350
YPL144W	75	63	100	55

Le tableau GSE89530_samples.tsv.gz fournit une description de chaque échantillon.

# print(samples[some.samples, ])
kable(samples[some.samples, ], 
      caption = "**Table de comptage de lectures (short reads) par gène.** Sélection arbitraire de quelques gènes (lignes) et échantillons (colonnes)", 
      align = "c")

**Table de comptage de lectures (short reads) par gène.** Sélection arbitraire de quelques gènes (lignes) et échantillons (colonnes)
	Condition	Replicate	Genotype	Time.point	Label
GSM2375285	Wild_type_4	2	Wild-type	4	Sc_WT_4h_2
GSM2375295	bdf1_Y187F_Y354F_mutant_8	3	bdf1-Y187F-Y354F mutant	8	bd1bd2mut_8h_3
GSM2375282	bdf1_Y187F_Y354F_mutant_4	1	bdf1-Y187F-Y354F mutant	4	bd1bd2mut_4h_1
GSM2375288	bdf1_Y187F_Y354F_mutant_4	2	bdf1-Y187F-Y354F mutant	4	bd1bd2mut_4h_2

Exploration des données

Avant toute autre chose, il convient de mener une exploration préliminaire des données, afin de se familiariser avec leur distribution.

Statistiques descriptives

La fonction R summary() calcule des statistiques de base pour chaque colonne d’une matrice ou data frame. Nous imprimons ici un sous-ensemble de ces échantillons.

summary(counts[, some.samples])

   GSM2375285         GSM2375295         GSM2375282       GSM2375288      
 Min.   :     0.0   Min.   :     0.0   Min.   :     0   Min.   :     0.0  
 1st Qu.:    30.2   1st Qu.:    35.2   1st Qu.:    32   1st Qu.:    20.0  
 Median :   254.0   Median :   239.0   Median :   262   Median :   173.0  
 Mean   :   809.9   Mean   :   919.0   Mean   :   903   Mean   :   638.4  
 3rd Qu.:   595.0   3rd Qu.:   643.0   3rd Qu.:   647   3rd Qu.:   435.8  
 Max.   :472819.0   Max.   :511934.0   Max.   :542630   Max.   :425896.0

Nous pouvons calculer quelques paramètres additionnels, qui nous éclaireront sur les données.

all.counts.vector <- unlist(counts) # Regroup all counts in a vevtor to compute statistics

count.stats <- data.frame(
  mean = mean(all.counts.vector),
  sd = sd(all.counts.vector),
  iqr = IQR(all.counts.vector),
  min = min(all.counts.vector),
  P05 = quantile(all.counts.vector, probs = 0.05),
  Q1 = quantile(all.counts.vector, probs = 0.25),
  median = quantile(all.counts.vector, probs = 0.5),
  Q3 = quantile(all.counts.vector, probs = 0.75),
  P95 = quantile(all.counts.vector, probs = 0.95),
  P99 = quantile(all.counts.vector, probs = 0.99),
  max = max(all.counts.vector)
  )

# View(count.stat) # for quick check in R interface
kable(t(count.stats), 
      caption = "Statistics on raw count values (all samples together)", 
      format.args = list(decimal.mark = '.', big.mark = ","), digits = 2,
      col.names = "Parameter value")

Statistics on raw count values (all samples together)
	Parameter value
mean	827.44
sd	8,891.07
iqr	524.00
min	0.00
P05	0.00
Q1	24.00
median	206.00
Q3	548.00
P95	2,321.70
P99	7,759.73
max	722,346.00

rm(all.counts.vector) ## Free memory space

Nous pouvons également appliquer ces méthodes à chaque échantillon séparément, au moyen de la fonction apply()

## Compute sample means using the apply() function
sample.means <- apply(counts, 2, mean)

## Compute different stats per sample and store them as columns of a data frame
sample.stats <- data.frame(
  label = samples$Label,
  mean = apply(counts, 2, mean),
  sd = apply(counts, 2, sd),
  zeros = apply(counts == 0, 2, sum),
  Q1 = apply(counts, 2, quantile, probs = 0.75),
  median = apply(counts, 2, median),
  Q3 = apply(counts, 2, quantile, probs = 0.75),
  P95 = apply(counts, 2, quantile, probs = 0.95),
  lib.size.Mb = apply(counts, 2, sum)/1e6
)

kable(sample.stats, 
      caption = "Sample-wise statistics", 
      digits = c(0,0,0,0,0,0,0,0,1), 
      format.args = list(decimal.mark = '.', big.mark = ","),
      align = "l")

Sample-wise statistics
	label	mean	sd	zeros	Q1	median	Q3	P95	lib.size.Mb
GSM2375281	bd1bd2mut_0h_1	1,007	10,212	957	684	253	684	2,952	7.5
GSM2375287	bd1bd2mut_0h_2	632	6,591	1,083	412	147	412	1,897	4.7
GSM2375293	bd1bd2mut_0h_3	636	6,584	1,078	423	151	423	1,898	4.8
GSM2375278	Sc_WT_0h_1	1,127	11,725	957	775	297	775	3,385	8.4
GSM2375284	Sc_WT_0h_2	521	5,592	1,101	362	135	362	1,567	3.9
GSM2375290	Sc_WT_0h_3	779	7,821	1,026	548	194	548	2,187	5.8
GSM2375282	bd1bd2mut_4h_1	903	9,814	811	647	262	647	2,569	6.8
GSM2375288	bd1bd2mut_4h_2	638	7,149	942	436	173	436	1,818	4.8
GSM2375294	bd1bd2mut_4h_3	732	8,118	850	515	208	515	2,102	5.5
GSM2375279	Sc_WT_4h_1	980	9,135	878	735	310	735	2,830	7.3
GSM2375285	Sc_WT_4h_2	810	8,039	898	595	254	595	2,264	6.1
GSM2375291	Sc_WT_4h_3	632	5,556	1,013	470	194	470	1,853	4.7
GSM2375283	bd1bd2mut_8h_1	804	9,438	835	500	190	500	2,187	6.0
GSM2375289	bd1bd2mut_8h_2	956	10,819	808	626	248	626	2,608	7.1
GSM2375295	bd1bd2mut_8h_3	919	9,672	862	643	239	643	2,689	6.9
GSM2375280	Sc_WT_8h_1	1,078	10,956	879	607	230	607	2,672	8.1
GSM2375286	Sc_WT_8h_2	756	8,022	893	476	189	476	1,942	5.7
GSM2375292	Sc_WT_8h_3	983	11,193	973	462	166	462	2,219	7.3

Comparaison moyenne - variance par gène

gene.stats <- data.frame(
  mean = apply(counts, 1, mean),
  var = apply(counts, 1, var),
  sd = apply(counts, 1, sd)
)


plot(x = gene.stats$mean, y = gene.stats$var,
     main = "Mean / variance plot",
     xlab = "Mean per gene",
     ylab = "Var per gene", log="xy",
     col = densCols(x = gene.stats$mean, y = gene.stats$var))
abline()

Mean-Variance plot

Distribution des comptages

## Compute some basic statistics

## Display histogram of the raw counts
hist(unlist(counts), 
     breaks = 100, 
     col = "#FFDDBB",
     xlab = "Reads per gene", 
     ylab = "Number of observations", 
     main = "Distribution of raw counts")

Cet histogramme n’est pas très informatif, car toutes les valeurs sont concentrées dans la première tranche (à l’extrême gauche). Ceci résulte du fiat que les intervalles de classe ont été définis sur base de l’étendue totale, et qu’il existe apparemment une observation qui a une valeur énorme par rapport aux autres (valeur aberrante, “outlier”). De fait, la valeur la plus élevée (722346) dépasse de très loin la moyenne (827.4361757)

Afin de visualiser toute l’étendue des observations tout en mettant plus de détail sur les valeurs faibles, nous pouvons effectuer une transformation logarithmique. Nous devons cependant prêter attention à certains détails.

Conventionnellement, on utlise la transformation log2 pour les données RNA-seq, car elle fournit un découpage plus fin des valeurs couvertes.
Les données RnA-seq contiennent généralement un bon nombre de valeurs nulles (gènes non détectés), qui posent un problème pour la conversion logarithmique (\(log(0) = -\infty\)). On contourne ce problème en ajoutant aux comptages un petit nombre arbitraire, qu’on dénomme pseudo-comptage et qu’on symbolise par la lettre grècque epsilon (\(\epsilon\)).

Il est cournant d’ajouter la valeur \(1\), mais nous préférons ajouter une valeur inférieure à 1, pour bien distinguer les comptages réels (qui peuvent de fait prendre une valeur 1) des pseudo-comptages.

Pour cette analyse nous choisissons \(\epsilon = 0.1\).

La conversion donne donc.

\[\text{log2count}= log2(n + \epsilon) = log2(n + 0.1) \] L’histogramme des log2counts est plus informatif que celui des comptages bruts.

counts.log2 <- log2(counts + parameters$epsilon)

hist(unlist(counts.log2), 
     xlab = "log2(counts + epsilon)", 
     ylab = "Number of observations", 
     main = "Distribution of log2(counts)", 
     breaks = 100, col = "#BBDDEE")

Notons d’emblée le pic très élevé à gauche, qui correspond à toutes les observations nulles. Sur l’axe \(X\), il apparait à la valeur \(-3.3\), qui correspond à \(log_2(\epsilon) = log_2(0.1)\).

Boîtes à moustache

Les boîtes à moustache sont très utilisées pour obtenir une vision d’ensemble de plusieurs distribution.

## Associate a specific color to each condition
conditions <- unique(samples$Condition)
condition.colors <- rainbow(n = length(conditions))
names(condition.colors) <- conditions

## Associate a color to each sample according to its condition
samples$color <- condition.colors[samples$Condition]

par.ori <- par(no.readonly = TRUE) # Store the original value of the graphical parameters before modifying them

# Box plot of counts and log2-transformed counts
par(mfrow = c(1,2))
par(mar = c(5.1, 8.1, 4.1, 1.1)) # Increase leftmargin for sample labels

boxplot(counts, horizontal = TRUE, las = 1, names = samples$Label, col = samples$color, xlab = "Raw counts")

boxplot(counts.log2, horizontal = TRUE, las = 1, names = samples$Label, col = samples$color, xlab = "log2counts")

Boxplot of the counts per gene in each sample. Left: raw counts. Right: log2_transformed counts.

par(par.ori)

Violin plots

# Violin Plots
par(mfrow = c(1,2))
par(mar = c(5.1, 8.1, 4.1, 1.1)) # Increase left margin for sample labels
par(las = 1)
vioplot(as.list(counts), horizontal = TRUE, 
        col = samples$color, xlab = "Raw counts",
        main = "Violin plot\nRaw counts",
        names = samples$Label)

vioplot(as.list(counts.log2), horizontal = TRUE, 
        col = samples$color, xlab = "Log2(counts + epsilon)",
        main = "Violin plot\nlog-transformed counts",
        names = samples$Label)

Violin plots. Left: raw counts. Right: log2-transformed counts.

par(par.ori)

Filtrage des gènes

Gènes à variance nulle (valeur constante)

## Zero-variance filter
gene.var <- apply(counts, 1, var)

## Define a Boolean vector (TRUE/FALSE) 
## indicating whether each gene has a null variance.
zero.var.genes <- gene.var == 0

kable(table(zero.var.genes))

zero.var.genes	Freq
FALSE	6918
TRUE	560

## Count the number of genes having a zero variance
# sum(gene.var == 0)

Nous écartons les gènes qui ont une variance nulle (autrement dit, qui ont les mêmes valeurs pour tous les échantillons), puisque leurs moyennes seront forcément identiques entre conditions. Dans notre jeu de données, ceci nous amène à écarter 560

Pourcentage de valeurs nulles

## Discard genes having zeros in at least 95% of samples
message("Applying threshold on the percent of non-zero counts per gene: ", parameters$gene.filter.percent.zeros, "%")

## A Boolean table indicating whether each count is null (TRUE) or not (FALSE)
zero.counts <- counts == 0 

## Count number of zero values per gene (=row of the expression table)
percent.zeros <- 100*apply(zero.counts, 1, sum) / ncol(counts)

# Note: we store the histogram values in a variable named "h" for further use
h <- hist(percent.zeros, 
          breaks = 20, col = "#DDDDDD", 
          main = "Filter on the percentage of zero counts", 
          xlab = "Percent of samples", ylab = "Number of genes", las = 1)

# View(h)

## Get histogram max counts (y value) to position the arrow
h.max <- max(h$counts) 
arrows(x0 = parameters$gene.filter.percent.zeros, 
       y0 = h.max * 0.5, 
       x1 = parameters$gene.filter.percent.zeros, 
       y1 = h.max * 0.3, 
       col = "red", lwd = 2,
       angle = 30, length = 0.1)
arrows(x0 = parameters$gene.filter.percent.zeros, 
       y0 = h.max * 0.5, 
       x1 = 100, 
       y1 = h.max * 0.5, code = 0,
       col = "red", lwd = 4,
       angle = 30, length = 0.1)
text(x = parameters$gene.filter.percent.zeros, 
     y = h.max*0.5, 
     labels = paste(sep = "", parameters$gene.filter.percent.zeros, "%"),
     col = "red", pos = 3)

Frequency of samples with zero counts per gene. Genes exceeding the thresold (red arrow) were filtered out.

Comptages minimaux par gène

Un autre critère possible est de supprimer les gènes faiblement détectés, en écartant les gènes pour lesquels les comptages sont inférieurs à un seuil donné pour tous les échantillons. Nous fixons ici (arbitrairement) le seuil à 10.

Nous procédont comme suit:

Calculer pour chaque gène \(i\) le comptage maximal observé parmi tous les échantillons.

\[x_{max,i} = \text{max}_{j = 0}^{s} x_{i,j}\]

où \(i\) est l’indice de lignes (gènes), \(j\) l’indice de colonnes (échantillons), et \(s\) le nombre d’échantillons.

Tester si la valeur maximale observée est inférieure au seuil minimum.

max.per.gene <- apply(counts, 1, max)

# View(summary(min.count))
h <- hist(log2(max.per.gene + parameters$epsilon), breaks = 100, col = "#BBBBFF",
          xlab = "log2(max count per gene)",
          ylab = "Number of genes", las = 1,
          main = "Filtering on min count per gene")
h.max <- max(h$counts)
arrows(x0 = log2(parameters$gene.filter.min.count), 
       y0 = h.max * 0.5, 
       x1 = log2(parameters$gene.filter.min.count), 
       y1 = h.max * 0.3, 
       col = "red", lwd = 2,
       angle = 30, length = 0.1)
arrows(x0 = log2(parameters$epsilon), 
       y0 = h.max * 0.5, 
       x1 = log2(parameters$gene.filter.min.count), 
       y1 = h.max * 0.5, 
       col = "red", lwd = 4, code = 0,
       angle = 30, length = 0.1)
text(x = log2(parameters$gene.filter.min.count), 
     y = h.max * 0.5, 
     labels = paste(sep = "", "log2(", 
                    parameters$gene.filter.min.count,
                    ") = ", signif(digits = 3, log2(parameters$gene.filter.min.count))),
     col = "red", pos = 3)

Distribution of max counts per gene. Genes below the thresold (red arrow) are filtered out.

# Build a data frame with one row per gene and one column per filtering criterion
discarded.genes <- data.frame(
  zero.var = zero.var.genes,
  too.many.zeros = (percent.zeros > parameters$gene.filter.percent.zeros),
  too.small.counts = max.per.gene < parameters$gene.filter.min.count
)


## Print the discarding criteria for some genes 
kable(discarded.genes[some.genes, ], caption = "Gene filtering criteria. TRUE indicates that a gene is discarded. ")

Gene filtering criteria. TRUE indicates that a gene is discarded.
	zero.var	too.many.zeros	too.small.counts
YLR221C	FALSE	FALSE	FALSE
YJL037W	FALSE	FALSE	FALSE
YOR252W	FALSE	FALSE	FALSE
YKL166C	FALSE	FALSE	FALSE
YJL052W	FALSE	FALSE	FALSE
YLL018C-A	FALSE	FALSE	FALSE
YOR337W	FALSE	FALSE	FALSE
YJL122W	FALSE	FALSE	FALSE
YIR007W	FALSE	FALSE	FALSE
YPL144W	FALSE	FALSE	FALSE

## Draw a venn diagram indicating the number of genes 
## discarded by the different criteria. 
venn.counts <- vennCounts(discarded.genes)
vennDiagram(venn.counts, cex = 0.8,
            main = "Genes discarded by different criteria")

Number of genes discarded during the filtering step.

## Genes passing the filters are those for which 
## all the discarding criteria are FALSE, 
## i.e. the sum of the row is 0
filtered.genes <- apply(discarded.genes, 1, sum) == 0

## Select a matrix with the filtered genes, 
## i.e. those not discarded by any criterion
filtered.counts <- counts[filtered.genes, ]

## Update the set of test genes to avoir NA values
some.genes <- sample(1:nrow(filtered.counts), size = 10, replace = FALSE)

Reproductibilité des réplicats

Nous pouvons comparer les réplicats pour une même condition au moyen d’un nuage de points, avec la fonction plot().

## Sélectionner les échantillons de la condition "test"
message("Comparing counts between replicates for condition", parameters$test.group)
selected.samples <- samples$Condition  == parameters$test.group
plot(counts.log2[, selected.samples], 
     col = samples[selected.samples, "color"])

Between-replicate comparison of counts per gene for the test condition.

Détection de gènes différentiellement exprimés avec edgeR

Comparaison entre 2 groupes

Dans un premier temps, nous allons effectuer une simple comparaison de 2 groupes: sauvage versus mutant au temps 0.

## Detection of Differentially Expressed Genes (DEG) with edgeR
message("Detecting Differentially Expressed Genes (DEG) with edgeR")


## Select the subsets of counts (columns) and samples (rows) corresponding to the control and test groups
control.samples <- which(samples$Condition == parameters$control.group)
test.samples <- which(samples$Condition == parameters$test.group)
selected.samples <- c(test.samples, control.samples)

## Select samples for a 2-group

## Build a "model matrix" from the class labels
## This matrix contains one row per sample and one column per class
designMat <- model.matrix(~ as.vector(samples[selected.samples, "Condition"]))
# View(designMat)

## Build an edgeR::DGEList object which is required to run edgeR DE analysis
dgList <- DGEList(counts = filtered.counts[, selected.samples])
# class(dgList)
# is(dgList)

## Estimate the dispersion parameters. 
message("\tedgeR\tEstimating dispersion")
dgList <- estimateDisp(dgList, design = designMat)
dgList <- estimateTagwiseDisp(dgList, design = designMat)

## Fit edgeR model for differential expression analysis.
## We chose glmQLFit because it is claimed to offer a more accurate control of type I error. 
message("\tedgeR\tmodel fitting with glmQLFit()")
fit <- glmQLFit(dgList, design = designMat)

## Run test to detect differentially expressed genes
message("\tedgeR\tdetecting differentially expressed genes with glmQLFTest()")
qlf <- glmQLFTest(fit, coef = 2:ncol(designMat))
qlf.TT <- topTags(qlf, n = nrow(qlf$table), sort.by = "none",
                  adjust.method = "fdr")


## Select differentially expressed genes
edgeR.DEG.table <- as.data.frame(qlf.TT$table)

## Compute some additional statistics
edgeR.DEG.table$evalue <- edgeR.DEG.table$PValue * nrow(edgeR.DEG.table)
edgeR.DEG.table$rank <- rank(edgeR.DEG.table$FDR, ties.method = "average")
edgeR.DEG.table$positive <- edgeR.DEG.table$FDR < parameters$alpha
# table(edgeR.DEG.table$positive)
# names(edgeR.DEG.table)
# View(edgeR.DEG.table)
# sum(egeR.DEG)

Exercices (solutions ci-dessous)

Dessinez un nuage de points (plot()) comparant les P-valeurs ajustées et non-ajustées.
Quel serait le nombre de faux-positifs attendus sous hypothès nulle si l’on appliquait le seuil \(\alpha = 0.05\) à la p-valeur non-ajustée ?
Comptez le nombre de gènes déclarés positifs selon qu’on applique le seuil \(\alpha = 0.05\) à la p-valeur ajustée ou non-ajustée.
Dessinez un histogramme (hist()) des P-valeurs non ajustées, avec 20 intervalles de classe (breaks = 20). Observez la répartition des gènes dans la moitié inférieure (p-valeur < 0.5) et supérieure (p-valeur > 0.5) de l’histogramme. Interprétez le résultat en 2 ou 3 phrases. A quoi s’attendrait-on si tous les gènes étaient sous hypothèse nulle ?
Dessinez un nuage de points (plot()) comparant le log2(fold-change) en abscisse et la P-valeur en ordonnée. Interprétez le résultat en 2 ou 3 phrases. Où se trouvent les gènes signicatifs ?
Dessinez un volcano plot, c’est-à-dire un nuage de points (plot()) présentant en abscisse le log2(fold-change), et en ordonnée la significativité, définie comme suit.

\[\text{sig} = -log_{10}(\text{FDR})\]

Interprétez le résultat en 2 ou 3 phrases. Commentez la relation entre le logFC et la significativité. Où se trouvent les gènes signicatifs ?

Adjusted versus non-adjusted P-values

# class(qlf.TT)
plot(edgeR.DEG.table$PValue, edgeR.DEG.table$FDR, 
     main = "Multiple testing correction",
     xlab = "Nominal p-value",
     ylab = "FDR",
     log = "xy", 
     col = densCols(x = edgeR.DEG.table$PValue,
                    y = edgeR.DEG.table$FDR),
     panel.first = grid(), 
     las = 1)
abline(h = parameters$alpha, col = "#BB0000")
abline(v = parameters$alpha, col = "#FF0000", lty = "dashed")
legend("topleft",
       legend = c(
         paste(sep = "", "p-value < ", parameters$alpha, ": ", 
               sum(edgeR.DEG.table$PValue < parameters$alpha), " genes"),
         paste(sep = "", "FDR < ", parameters$alpha, ": ", sum(edgeR.DEG.table$FDR < parameters$alpha), " genes" )))

Ajusted (ordinate) versus non-adjusted (abscissa) p-values returned by edger. Strong colors indicate a higher density of overlapping points. Note the strong impact of the multiple testing correction.

Histogram of the nominal P-values

## P-value histogram
hist(edgeR.DEG.table$PValue, 
     breaks = 20, col = "#DDEEFF", las = 1,
     main = "edgeR P-value histogram",
     xlab = "Nominal P-value", 
     ylab = "Number of genes")

Histogram of edgeR nominal P-values.

Volcano plot

# Quick test: plot the different symbols
# plot(1:30, pch = 1:30)


# Assign a graphical symbol to each gene according to its positive/negative status
edgeR.DEG.table$pch <- 1 # circle symbol
edgeR.DEG.table$pch[edgeR.DEG.table$positive] <- 3 # + symbol

par(mfrow = c(1,2))
plot(x = edgeR.DEG.table$logFC, 
     y = -log10(edgeR.DEG.table$PValue),
     las = 1, 
     xlab = "log2(fold-change)",
     main = "Volcano plot of edgeR unadjusted p-values",
     ylab = "-log10(P-value)",
     pch = edgeR.DEG.table$pch, 
     col = densCols(x = edgeR.DEG.table$logFC, 
                    y = -log10(edgeR.DEG.table$PValue)),
     panel.first = grid())
abline(v = 0)
abline(h = 0)

plot(x = edgeR.DEG.table$logFC, 
     y = -log10(edgeR.DEG.table$FDR),
     las = 1, 
     xlab = "log2(fold-change)",
     main = "Volcano plot of edgeR FDR",
     ylab = "-log10(P-value)",
     pch = edgeR.DEG.table$pch, 
     col = densCols(x = edgeR.DEG.table$logFC, 
                    y = -log10(edgeR.DEG.table$FDR)),
     panel.first = grid())
abline(v = 0)
abline(h = 0)
abline(h = -log10(parameters$alpha), col = "#BB0000")

Volcano plots of edgeR unadjusted (left) and adjusted (right) P-values. Multple testing correction method: FDR.

par(mfrow = c(1,1))

Détection de gènes différentiellement exprimés avec DESeq2

Nous allons maintenant utiliser DESeq2 pour détecter des gènes différentiellement exprimés sur le même jeu de données. Nous comparerons ensuite les résultats obtenus avec edgeR et DESeq2, respectivement.

Comparaison de 2 groupes